DETERMINACIÓN DE LA HEMOGLOBINA
Objetivo:
Determinar cuántos gr de hemoglobina (Hb) hay en toda la sangre circulante,
para tener un diagnóstico clínico ya que se pueden variar diversas enfermedades
debido a un valor anormal de Hemoglobina.
Fundamento:
La hemoglobina es una proteína conjugada que sirve para el transporte de
oxígeno y dióxido de carbono. La masa total de eritrocitos de un adulto
contiene unos 600gr. De hemoglobina capaces de transportar 800ml de oxígeno.
Una molécula de hemoglobina consta de 2 pares de cadenas polipépticas
(unión de aminoácidos) (globina) y 4 grupos proteicos HEM que contienen cada
uno un átomo de Hierro en estado ferroso. Cada punto HEM se localiza en una
zona determinada de una de las cadenas polipépticas. Localizando cerca la
superficie de la molécula, el HEM se combina de forma reversible con una
molécula de oxígeno y dióxido de carbono. Este grupo HEM es el responsable del
color rojo de la hemoglobina (Hb).
La parte proteica o globina tiene 4 cadenas poli peptídicas que se
denominan con las letras α, β, γ, δ. Existe una cadena más la ε que está
presente durante los 3 primeros meses de vida se diferencian unas de las otras
en el numero o posición (de los aminoácidos de los que están compuestas). Por
lo tanto existen varios tipos de Hb en el ser humano se pueden encontrar las
siguientes hemoglobinas normales:
Hemoglobina A: consta de 2 cadenas α y 2 cadenas β en un adulto normal
corresponde a más del 95% del total.
Hemoglobina F (fetal): consta de 2 cadenas α y 2 cadenas γ. Es la
hemoglobina principal en el feto desde el 4° mes del embarazo hasta
aproximadamente los 6 meses de edad. La Hb F tiene mayor afinidad por el oxígeno.
Hemoglobina Gower: consta de 2 cadenas α y 2 cadenas ε. Desaparece casi por
completo en el tercer mes de embarazo y empieza a aparecer la Hb fetal.
Algunos datos se obtienen examinando a simple vista una muestra de sangre.
Un aspecto normal del suero o del plasma revela que el pigmento esta en los
glóbulos rojos. Si se agita en una sangre total normal en el aire durante 15
min. Adquiere un color rojo claro por convertir la Hb en oxihemoglobina.
La sangre tiene un color rojo cereza brillante cuando el pigmento es
carboxihemoglobina en la intoxicación por CO. El color es chocolate en la
metahemoglobulemia y la banda malvada en alsulfohemoglobulemia.
Las distintas Hb tienen espectros de absorción características a las que
determina en un espectrofotómetro. La identificación de diferentes formas de la
Hb con la determinación de sus espectros de absorción puede hacerse de una
manera sencilla
Material y Equipo:
· Un colorímetro fotoeléctrico o un espectrofotómetro.
· Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL
· Pipeta semiautomática
· Tubos de ensayo.
· Gradilla
· gasa
Reactivos:
· EDTA
· Reactivo Drabkin
· Ferrocianuro de potasio
· Cianuro de potasio
· Bicarbonato de potasio
· Solución estándar de cianometahemoglobina
Reactivos biológicos:
· Sangre venosa con EDTA.
Técnica:
1.-En un tubo de 13 x 100 colocar exactamente 5 mL de reactivo de Drabkin,
marcarlo como problema (P).
2.-Obtener 5 ml de sangre venosa con anticoagulante (EDTA).
3.- Mezclar perfectamente la sangre problema, por inversión por lo menos 20
veces antes de tomar la muestra.
4.-Con una pipeta automática o pipeta de Shali se toma exactamente 0,02 mL
(20 µL) de sangre total, limpiar luego la punta de la pipeta.
5.-La sangre tomada del tubo con EDTA se vierte en el tubo que contenga
reactivo de Drabkin. Se enjuaga 3 veces y se mezcla.
6.- Mezcle la solución de Drabkin con la sangre por inversión (utilizando
papel parafilm para tapar los tubos).
7.-Dejar en reposo por espacio de 3 a 5 minutos. Para que
se efectúe la reacción.
8.-Después de ese tiempo se observara una coloración roja transparente, se
llena las cubetas (tubos) hasta la marca que se encuentra y se procede la
lectura.
9.-Leer en absorbancia con filtro verde a 100 nm llevando a cero el
fotómetro con agua destilada / Drabkin.
PARA HACER LA MEDICION DE TRANSMITANCIA HACER EL SIGUIENTE PROCEDIMIENTO:
Medición de Transmitancia:
1.- Encender el
Espectrofotómetro 30 minutos antes, después seleccione la longitud
de onda deseada 100nm para Hb)
2.-Presione la tecla modo para
la Transmitancia.
3.-Insertar la cubeta con
el blanco en el espectrofotómetro, cierre la puerta.
4.-Remueva el blanco e
inserte la muestra problema contenida en la celda y cierre la
Puerta.
Aparecerá en la
pantalla el valor en Transmitancia.
6.-Retire la cubeta del
compartimiento y cierre la puerta (lave la cubeta y guárdela).
Resultado:
Muestra
1= .294 absorbancia
Muestra 2= .337absorbancia
Cálculos:
Muestra 1: .294/.340 x 15 = 12.9705 g/dL
Muestra 2: .337/.340 x 15 = 14.8675 g/dL
Cálculos:
Hb total = concentración de Hb (gr/ml) x volumen sanguíneo (ml).
En espectrofotómetro se
aplica la siguiente formula:
muestra/ estándar x 15 = Hb
Valores de referencia:
Niños al nacer…………………………….. 13,6 - 19,6 g/dL
Niños de 1 año…………………………..... 11,3 - 13,0 g/dL
Niños de 10 -12 años……………………... 11,5 - 14,8 g/dL
Mujeres……………………………………... 11,5 - 16,5 g/dL
Hombres……………………………………. 14,0 - 18,0 g/dL
Tubo de Wintrobe.
